Todos os arquivos estão disponíveis em: https://github.com/Gnoogit/somatico_2024.git.
Para maiores informações sobre este workflow, favor visitar: https://sites.google.com/view/somaticamielofibrose.
- Caio Elias (caielias@hotmail.com)
- Clara Gusmão (clara.sabenca.gusmao@gmail.com)
- Gabriel Oliveira (gbnoliveira@gmail.com)
- Gilson Borges (gilson.borges20@gmail.com)
- José Filho (jose.oliveira-filho@unesp.br)
- Kaira Tomaz (kairatomaz@gmail.com)
- Clonagem do repositório do projeto
- Instalação dos recursos necessários
- Filtragem das variáveis de interesse
- Análise de resultados
- Conclusão
Com o comando git clone, podemos importar todos os arquivos de uma única vez. O repositório contém as amostras necessárias para análise, assim como scripts extras e arquivos de referência.
%%bash
git clone https://github.com/Gnoogit/somatico_2024.git
a) Instalar bcftools com o plugin split-vep.
O plugin permite extrair os campos de anotações estruturadas como INFO/CSQ criadas por bcftools/csq ou VEP (em nosso caso VEP).
Mais informações: https://samtools.github.io/bcftools/howtos/plugin.split-vep.html
%%bash
git clone --recurse-submodules https://github.com/samtools/htslib.git
git clone https://github.com/samtools/bcftools.git
cd bcftools
make
make install
b) Instalar udocker.
Udocker é uma ferramenta básica para executar containers docker simples em sistemas sem privilégios de root. Esta abordagem de rodar como sudo será apenas utilizada no workflow pois ele foi elaborado para ser utilizado com o Google Colab e não é recomendada.
Em nosso caso, sempre que utilizarmos o comando udocker rodamos com a opção docker --allow-root.
Mais informações: https://indigo-dc.github.io/udocker/
%%bash
pip install udocker
udocker --allow-root install
c) Download imagem do ensembl-vep.
Ensembl vep é um conjunto de ferramentas para predição de impactos de variantes. Neste workflow, usaremos o comando de filtragem do vep, para filtrar as variáveis de interesse. Como o udocker foi instalado, é possível fazer o download da imagem do vep usando udocker --allow-root pull.
Mais informações: https://grch37.ensembl.org/info/docs/tools/vep/index.html
%%bash
udocker --allow-root pull ensemblorg/ensembl-vep
A filtragem das variáveis é executada no script vep-gc.sh. O arquivo Myelofibrosis.txt possui uma lista dos genes de interesse. Para mais informações sobre o script, favor consultar o script completo no repositório.
(Neste workflow, foram utilizadas as amostras do projeto LMA Brasil. Os arquivos VCF do projeto foram convertidos previamente da versão do genoma hg19 para hg38 utilizando o programa gatk LiftoverVcf com as posições hg19ToHg38.over.chain da UCSC.)
%%bash
sh somatico_2024/vep-gc.sh Myelofibrosis.txt
a) Utilizamos então a ferramenta pandas no código abaixo para gerar uma tabela unificada com as variáveis de interesse a partir das saídas do script vep-gc.sh. Pandas é uma ferramenta para análise e manipulação de dados em Python.
Mais informações: https://pandas.pydata.org/
import pandas as pd
import os
pd.set_option('display.max_columns', None)
pd.set_option('display.max_colwidth', None)
output_folder = '/content/somatico_2024/my_samples/vep_output/'
output_path = '/content/df_merged.csv'
dataframes = []
for final_outputs in os.listdir(output_folder):
if final_outputs.endswith('.tsv'):
output_pathway = os.path.join(output_folder, final_outputs)
df = pd.read_csv(output_pathway, sep='\t', index_col=False)
df['Sample'] = final_outputs.split('_')[1]
dataframes.append(df)
df_merged = pd.concat(dataframes, ignore_index=True)
df_merged.to_csv(output_path, index=False)
b) Com a tabela unificada, é possível gerar um gráfico que mostra o número de variantes que cada amostra apresenta. As amostras que não aparecem no gráfico não possuem variantes de interesse.
df_merged_sample_chart = df_merged.value_counts("Sample")
df_merged_sample_chart.plot.bar(x='Sample')
c) Com a mesma tabela, é possível gerar também um gráfico que mostra a distribuição das variantes de interesse para cada gene. Alguns genes não aparecem no gráfico pois não foram encontradas variantes de interesse nos mesmos, dentre as amostras analisadas.
df_merged_chr_chart = df_merged.value_counts("SYMBOL")
df_merged_chr_chart.plot.pie(y='SYMBOL', figsize=(5, 5), autopct='%1.1f%%', startangle=90)
d) Com um pouco de manipulação em nossa tabela, conseguimos gerar um gráfico que relaciona a patogenicidade das variantes de acordo com os genes estudados. Alguns genes não aparecem no gráfico pois não foram encontradas variantes de interesse nos mesmos, dentre as amostras analisadas.
Dos genes em questão, encontramos anotações de patogenicidade para os genes KRAS, NRAS e TP53.
clin_sig_split = pd.DataFrame()
clin_sig_split_and = pd.DataFrame()
clin_sig_split_or = pd.DataFrame()
clin_sig_split_and = df_merged['CLIN_SIG'].str.split('&',expand=True)
for col1 in clin_sig_split_and:
if clin_sig_split_and[col1].str.contains('/').any():
clin_sig_split_or = clin_sig_split_and[col1].str.split('/',expand=True)
for col2 in clin_sig_split_or:
clin_sig_split['CLIN_SIG_'+str(len(clin_sig_split_and.columns)+col2+1)] = clin_sig_split_or[col2]
else:
clin_sig_split['CLIN_SIG_'+str(col1)] = clin_sig_split_and[col1]
clin_sig_split_pathogenic = clin_sig_split.where(clin_sig_split=='pathogenic')
clin_sig_split_likely_pathogenic = clin_sig_split.where(clin_sig_split=='likely_pathogenic')
df_merged_clin_chart = pd.DataFrame()
df_merged_clin_chart['SYMBOL'] = df_merged['SYMBOL']
df_merged_clin_chart['Pathogenic'] = clin_sig_split_pathogenic[clin_sig_split_pathogenic.columns[0:]].apply(lambda x: int(bool(''.join(x.dropna().astype(str)))),axis=1)
df_merged_clin_chart['Likely Pathogenic'] = clin_sig_split_likely_pathogenic[clin_sig_split_likely_pathogenic.columns[0:]].apply(lambda x: int(bool(''.join(x.dropna().astype(str)))),axis=1)
df_merged_clin_chart['Likely Pathogenic'] = df_merged_clin_chart['Likely Pathogenic'] - ( df_merged_clin_chart['Pathogenic'] * df_merged_clin_chart['Likely Pathogenic'] )
df_merged_clin_chart[( df_merged_clin_chart['Pathogenic'] != 0 ) | ( df_merged_clin_chart['Likely Pathogenic'] != 0 )].groupby('SYMBOL').sum().plot.bar(stacked=True, title='Pathogenicity of variants per gene')
Podemos concluir que, apesar do baixo número de variantes encontradas, nossa análise está de acordo com a literatura pois demonstra alterações patogênicas nos genes KRAS, NRAS e TP53 e provavelmente patogênicas no gene U2AF1.
